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立体异构体（Stereoisomers）是指分子中的结构基团在空间三维中排列不同而原子组成、原子-原子连接方式以及键合顺序不发生改变的化合物。立体异构体分为对映异构体（Enantiomers）和非对映异构体（Diastereoisomers）两大类。对映异构体（即对映体）是指在空间上不能重叠，互为镜像关系的立体异构体，就像人的左右手一样，称为具有“手”性[1]。含有两个互为对映异构体的化合物称为手性化合物，其中仅含一个对映体的化合物称为光学纯手性化合物。左手性和右手性的对映异构体组成的等摩尔混合物称之为外消旋体。

图1 手性对映体

生物大分子如蛋白质、多糖、核酸等均有手征性。除细菌等生物以外蛋白质都是由左旋的L-氨基酸组成；多糖和核酸中的糖则是右旋的D-构型。它们在生物体内形成手性环境。药物在进人生物体内后，其药理作用多与它和体内靶分子之间的手性匹配和分子识别能力有关。因此含手性的化学药物的对映体在人体内的药理活性、代谢过程及毒性存在着显著差异，利用“手性”的原理与技术开发新药，已经成为国际医药界的新方向之一[2]。

手性药物分类

手性药物按其作用可分为下述6种情况[3]：

一种对映体为另一种对映体的竞争性拮抗剂，如：（-）-异丙肾上腺素和（+）-异丙肾上腺素。

对映体具有相反的作用，如：二氢吡啶类拮抗剂，S-型对映体为L型电压依赖性钙通道的强激活剂，而R-型对映体多为阻滞剂。

一种对映体主要具有治疗作用，另一种对映体主要产生副作用，如：氯胺酮S-型对映体发挥麻醉镇痛作用，而R-型对映体则产生中枢兴奋作用；反应停（thalidomide）胚胎毒性和致畸作用主要由S-型对映体产生。

两种对映体产生类型不同的药理作用，都可作为治疗药物，如：右旋丙氧酚是镇痛药，左旋丙氧酚对映体却是止咳药。

对映体作用的互利性，如：普洛萘尔的S-型对映体主要阻断β受体，而R-型对映体对钠通道具有抑制作用，以外旋体给药时抗心律失常作用好。

一个对映体具有药理活性，另一个对映体无活性或活性很弱，如左氧氟沙星的体外抗菌活性是右氧氟沙星的8-128倍。

研究和开发手性药物的重要性

过去手性药物往往以外消旋体形式出售。1961年出现了外消旋的镇静剂反应停(Thalidomide)被孕妇服用后产生畸胎事件，直到1965年人们才发现反应停的R-对映体为镇静剂，而另一种S-对映体非但没有镇静作用，而且有致畸作用[2]。

在此之后的研究表明，这不是个别现象，很多手性药物都有类似情况。手性药物的两对映体虽然具有相似的理化性质，但在体内手性环境中却具有高度的立体选择性，表现出不同的药动学和药效学，因此手性药物的临床疗效是药物生物活性立体选择性和体内过程立体选择性的综合结果。表1中的例子说明，不少药物和毒物的差别仅为两个不同立体构型的对映体，严重的甚至会直接危及人体的生命健康，因此在药物研发进程中应对每一个含手性中心的药物进行对映体药理研究。

表1 不同对映体的不同药理作用[2]

手性药物的ADME

在人体的手性环境中，手性药物对映体与生物大分子间相互识别、相互作用的立体选择性导致了手性药物的药理学差异，即药理学立体选择性。药理学立体选择性分为药效学立体选择性(stereo-selectivity in pharmacodynamics)和药物动力学立体选择性(stereo-selectivity in pharmacokinetics)。药效学立体选择性是指手性药物对映体间的药效学作用及其机制存在着差异。药物动力学立体选择性是指手性药物对映体在吸收、分布、代谢和消除过程中具有差异。临床常用的手性药物中90%以外消旋体给药，这种给药方式所产生的问题引起了越来越广泛的关注和重视。

1. 吸收（Absorption）

多数药物的吸收都是被动扩散的过程，其吸收的速度和程度取决于药物的脂溶性。由于两个手性对映体的脂溶性和水溶性并无明显的差别，因此通过生物膜被动扩散的吸收不存在立体选择性。而手性药物在经过主动转运或易化转运方式进行吸收时，由于细胞膜载体或酶可识别药物的空间结构，则会出现立体选择性，造成对映体在吸收上的差异。当手性药物在胃肠道经主动转运进行吸收时，两个对映体的吸收特性有可能存在着显著差别，而且许多手性药物在发生首过消除反应时会呈现出立体选择性。β-内酰胺类抗生素头孢氨苄的D-对映体经肠道的二肽转运系统被主动吸收，且二肽转运系统对D-对映体的转运具有专一性和饱和性，而L-对映体能抑制D-对映体的吸收。β受体阻断剂普莱洛尔，R-异构体较易发生首过效应，而药理活性较强的S-异构体则较少发生。另外，不同药物浓度、pH值、助溶剂和给药间隔也对药物立体选择性的吸收有一定的影响。例如，β-受体阻断剂普萘洛尔，在应用其亲脂性前药透皮吸收时，皮肤酯酶的立体选择性倾向于水解R-普萘洛尔而吸收S-普萘洛尔[4]。

2. 分布（Distribution）

药物的分布程度取决于药物的脂溶性和药物与血浆蛋白、组织的结合能力。药物透膜的分配系数通常不受手性影响，但药物对映体的蛋白结合率可能有很大差异。其立体选择性主要体现在与血浆蛋白或组织结合的过程中。

血浆蛋白结合

在血浆中，与游离药物结合的血浆蛋白主要有白蛋白（albumin）和β-酸性糖蛋白（β-acid glycoprotein），前者通常与酸性药物结合，而后者主要与碱性药物结合。手性对映体与这两类蛋白结合能力的不同，导致血浆蛋白结合的差异。在人体内，瑞波西汀（reboxetine）的(+)-对映体与(-)-对映体的AUC比值为0.15，因为活性较高的(+)-对映体蛋白结合率较低，而且从体内消除相对较快[5]。

组织分布

手性药物在组织中的分布也同样存在着立体选择性，这种选择性除与血浆蛋白中药物的游离分数有关外，还和药物与组织结合、跨膜转运等特性有关。据MIRANDA等人报道，非诺洛芬存在组织分布立体选择性，如关节炎患者的关节腔膜液中，有活性的S-对映体的AUC大约是R-对映体的10倍[6]。

3. 代谢（Metabolism）

对映体的代谢途径

在已研究的手性药物中，绝大多数药物代谢表现出不同程度的底物立体选择性，有关该方面的研究主要集中在CYP450酶系所参与的氧化还原反应里。一种药物不同代谢途径的立体选择方向的差异，其与受不同的CYP450同工酶催化密切相关。另一方面，有些对映异构体尽管是由相同的代谢酶催化代谢，但是由于同一种酶对异构体的亲和力不同，或者参与对映体药物代谢的几种代谢酶的比例不同，都将导致两者在体内代谢速度和代谢量的差异[4]。β-受体阻断剂普萘诺尔在体内经CYP2D酶系氧化代谢，主要产生4-OH-普萘诺尔，以及5-OH-普萘诺尔和N-去丙基-普萘诺尔。在其药动学研究中，三种代谢产物的Km和Vm值均表现为R-对映体<S-对映体，而且三种代谢产物的量因种属的不同而略显差异[7]。

对映体间的相互转化

手性转化是指对映异构体在代谢过程中发生构型转化，从而使手性药物的代谢和动力学研究变得复杂化。对映体发生手性转化的器官主要是肝脏，其次是肾和胃肠道。研究对映体在体内的相互转化，可了解对映体是否通过转化为另一对映体而减慢另一对映体的消除而产生蓄积。反应停沙利度胺就是因其在体内发生快速的消旋化，其S异构体的致畸作用产生了数万名的海豹胎，成为人类历史上的灾难性的药物毒性反应[8]。

图2 沙利度胺的分子结构及相互转化

Iami T等人在研究普拉洛芬（pranoprofen）在猎犬中的立体选择性处置实验中发现，R-(-)-对映体转化为S-(+)-对映体的程度可达到14%，这种手性转化在减慢S-(+)-对映体在犬中的消除起着重要的作用[9]。

药物在胃肠道的吸收速率也会影响药物对映体的立体选择性药物动力学。如：口服消旋体布洛芬后，在胃肠道中无活性的R-对映体能够向有活性的S-对映体转化，药物在胃肠道停留时间越长，转化程度越大。Sattaris等对不同剂型布洛芬进行了体内动力学研究，服用布洛芬消旋体缓释颗粒剂后，S-对映体与R-对映体AUC之比（7.3±1.5）要显著高于混悬剂（3.6±1.1）和溶液剂（3.5±0.2）。结果表明体内两对映体的比率与药物从制剂中的释放速率呈显著相关性[10]。

4. 排泄（Excretion）

肾清除

肾脏是药物排泄的主要器官，肾排泄涉及肾小球滤过、肾小管主动转运及肾代谢等过程，后两个过程涉及肾的主动转运和代谢，因此对手性对映体的清除可能存在着立体选择性。给予大鼠索他洛尔消旋体后，其对映体的药-时曲线相似，而单独给予S-索他洛尔后，肾清除率从（33.7±6.0）降低至（28.9±5.6）mL/（min·kg）（P<0.05）；给予R-索他洛尔后，其清除率并无明显变化[11]。S-索他洛尔的肾清除率受肾血流量影响较大，而受肾排泄的影响较小，因此以消旋体给药后，R-索他洛尔的β-阻断作用引起的肾血流量改变，可能是导致S-索他洛尔的肾清除率发生变化的主要原因。

胆汁排泄

胆汁排泄是药物及其代谢产物的主要排泄途径之一。手性药物及其代谢产物在胆汁中排泄涉及主动过程和被动过程。已知胆管存在着三种转运系统，即有机酸、有机碱和中性化合物转运系统。这些转运系统介导的药物转运，往往存在着立体选择性。试验发现，大鼠分别静脉注射盐酸曲马朵和反式氧去甲基曲马朵后，(-)-反式曲马朵和(-)-反式氧去甲基曲马朵优先从胆汁中排泄[12]。

手性药物的分离方法

由上述内容可见手性药物的对映体分离是极其必要的。目前对映体分离的方法有：生物转化不对称催化法、液液萃取法、传感器法、渗透膜法、重结晶法、毛细管电泳法、色谱法。其中色谱法又可以分为：超临界流体色谱法（SFC）、气相色谱法（GC）、毛细管电色谱法（CEC）、高效液相色谱法（HPLC）。其中发展最快、应用最广的HPLC，具有高专属性、高灵敏度、高分离度的对映体拆分和测定方法，对提高手性药物的活性，减小副作用，深入研究作用机理等具有重要的理论和实际意义[13]。

HPLC拆分对映体可以采用间接法和直接法。间接法又称手性衍生化试剂法（CDR），利用手性试剂与被拆分物进行柱外衍生化反应生成非对映异构体，从而可被传统的手性HPLC拆分。直接法分为手性固定相法（CSP）直接分离和手性流动相添加剂法（CMPA）。因CMPA是在流动相中加入手性添加剂，产生非对映体离子对或络合物后，在色谱上进行分离，但由于手性添加剂的非挥发性而不适用于LC-MS，故最常用于定量的手性分析是手性衍生化试剂法和手性固定相法。

手性衍生化试剂法是可以提高分离度、选择性和灵敏度，但若手性衍生化试剂不纯或衍生化过程中存在代谢产物的降解（如Ⅱ相代谢产物降解）则会导致定量偏差。而且衍生化的过程一般繁杂、冗长，过量的试剂也会造成分析柱的损伤。

手性固定相法仍然是手性分析的首选，其优点是快速、简单、高效，种类较多，应用十分广泛。目前，国际上发展的高效液相色谱手性固定相很多，主要有以下几类：

Pikle型手性固定相（又称刷型手性固定相）：主要包括π-碱型（带推电子取代基）、π-酸型（带吸电子取代基）及氨基酸类。

配体交换手性固定相：建立在金属配合物的配体交换的基础之上的固定相。

大环手性固定相：主要包括大环抗生素手性固定相、环糊精手性固定相和冠醚手性固定相。

分装印迹手性固定相：利用分子模板而生成的有机高分子。

多肽或蛋白质手性固定相：常用的人α1-酸性糖蛋白（α1-AGP）、人血清白蛋白（HSA）、牛血清白蛋白（BSA）、卵类黏蛋白、纤维二糖水解酶（CBH）等。

糖肽类手性固定相：主要有万古霉素手性固定相和利福霉素B手性固定相。

多糖类手性固定相：主要包括纤维手性固定相和淀粉手性固定相。

生物样品中手性药物含量测定的方法研究

建立一个稳健的测定生物样品中手性药物含量的LC-MS法是非常具有挑战性的，因为：

①生物样品分析常使用HPLC-MS/MS法，采用的液相体系一般是反相体系，但很多手性分离条件的液相体系是正相体系[14]，见表2，该体系对质谱的电喷雾离子化(ESI)和大气压化学离子化(APCI)的离子化均不利；

②手性色谱柱的分离度通常低于非手性柱，且能改善分离效果的影响参数极少；

③在手性色谱柱上不易实现梯度洗脱；

④为了达到分离度的要求，分析运行时间一般较长；

⑤手性色谱柱稳定性和重现性比普通非手性柱差；

⑥手性色谱柱价格昂贵，购置很多不同种类的手性柱成本太高；

⑦手性分离的成败大部分取决于色谱工作者的经验和反复测试。

总而言之，手性方法的开发既困难又耗时。

表2 HPLC分离手性化合物[14]

建立手性色谱分离需先确定方法的分离体系，若旋光对映体的分离可以在多个手性固定相上实现，那么可以根据分离体系初步筛选手性色谱柱，如：极性有机相（含有机酸或碱的乙腈和甲醇的混合液），固定相可用环糊精；反相流动相（含挥发性酸、碱或缓冲液的乙腈和水的混合液），固定相常用蛋白质或多糖类型；正相流动相（含有或不含有挥发性酸、碱的正己烷、乙醇或异丙醇的混合液），固定相常用于多糖类型的手性柱。

而分析物对映体的分离是开发一个稳健的手性LC-MS/MS生物分析方法中最困难的一环。理想的分离是对映体在色谱上达到基线分离，且有尖而对称的窄峰。需要注意的是在方法开发时使用消旋体而实现的手性分离度，仅代表最佳状态，可能具有误导性，因为真实样品中对映体的浓度比例不一定是1:1。当分离不完全，色谱峰又有严重的拖尾，若较小的对映体在较大的对映体后洗脱，那么较小的对映体可能会被掩盖在较大的对映体峰下。在这种情况下，需要使用具有相反旋光性的手性柱或一个不同的手性柱，来实现两个对映体在大浓度差（CD)下的完全分离，或次要峰在主要峰前流出。

本实验室在“苯磺酸左旋氨氯地平（2.5mg/片）和苯磺酸氨氯地平（5mg/片）的生物等效性研究”中，快速地建立了HPLC-MS/MS法测定人血浆中左旋氨氯地平的浓度。采用将不易变性的卵类黏蛋白固定在硅胶上的色谱柱ULTRON ES-OVM（4.6×150mm，5μm），其具有广泛的手性识别，适用于反相体系分离，且灵敏度可达ng级，最终以16mM乙酸铵水溶液:乙腈=75:25作为反相流动相进行等度洗脱，将氨氯地平消旋体在色谱上有效地分离出左旋氨氯地平和右旋氨氯地平，见图4，且左旋氨氯地平的灵敏度为0.05 ng/mL，成功地应用到生物样品分析中，药时曲线如图5。

图3 氨氯地平的色谱图[15]

图4 口服受试制剂和参比制剂后的药时曲线图[15]

结语

手性药物的两对映体虽然具有相似的理化性质，但在体内手性环境中具有高度的立体选择性，表现出不同的药动学和药效学，因此手性药物的临床疗效是药物生物活性立体选择性和体内过程立体选择性的综合结果。若对有活性的对映体加以充分利用，避免活性差或无活性甚至有毒性的另一对映体，形成单一对映体药物，其具备疗效好、毒副作用小、安全性高等的优点，因此单一对映体药物的研发已经成为当前新药创新的重点，而开展手性药物的药代动力学研究和生物分析，对进一步了解药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程的特点，最大限度地发挥药效和降低毒副作用，指导临床合理用药，具有重要的理论和实践意义。

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